EMB agaras: pamatas, paruošimas ir naudojimas

EMB agaras yra selektyvi ir diferencinė kietosios kultūros terpė, naudojama gram-neigiamoms baciloms, daugiausia iš Enterobacteriaceae šeimos, ir kitų nereikalingų gramnegatyvių bacilių izoliavimui. Taip pat žinomas akronimas EAM, kuris reiškia eozino-metileno mėlyną.

Šią terpę sukūrė Holt-Harris ir Teague 1916 m. Jame yra peptono, laktozės, sacharozės, dikalio fosfato, agaro, eozino, metileno mėlynos ir vandens. Jis yra labai panašus į „MacConkey“ agarą, ypač jei naudojamas „Levine“ modifikuotas EMB agaras, kuriame nėra sacharozės.

Tiesą sakant, kiekviena laboratorija nusprendžia, ar ji veikia su vienu ar kitu, nes jos atlieka tą pačią funkciją, nors biochemiškai jos skiriasi.

Tai netgi tas pats trūkumas, kaip ir klasikinis „MacConkey“ agaras, susijęs su „Proteus“ genties produkcija. Todėl, siekiant išvengti šio reiškinio, agaro koncentraciją galima padidinti iki 5%.

Fondas

Selektyvus

EMB agaras yra subtiliai selektyvus, nes jame yra anilininių dažiklių (eozino ir metileno mėlynos spalvos), kurie veikia kaip inhibitoriai, užkertantys kelią daugumos gramteigiamų bakterijų ir kai kurių sunkių gramnegatyvių bakterijų augimui.

Tačiau šiam agarui trūkumas yra tas, kad kai kurios gramteigiamos bakterijos gali atsispirti inhibuojančių medžiagų buvimui ir augti kaip mažos, bespalvės, punkcinės kolonijos, tokios kaip Enterococcus faecalis ir kai kurios Staphylococcus .

Taip pat galite auginti tam tikras mieles, pvz., Candida albicans kompleksą, kuris suteiks labai mažas rožines kolonijas. Be to, iš šios mielės galima sukurti chlamidosporus, jei mėginys sėjamas giliai.

Diferencialas

Kita vertus, EMB agaras taip pat yra diferencinė terpė, nes šie dažai kartu (eozinas ir metileno mėlynas) pasižymi nuosėdų susidarymu rūgštiniame pH, todėl jie yra jo gamybos rodikliai.

Todėl silpnai fermentuojančios laktozės ar sacharozės bakterijos gamina violetines kolonijas per 24–48 valandas. Pavyzdžiui, genties Klebsiella, Enterobacter ir Serratia.

Tos bakterijos, kurios stipriai fermentuoja laktozę, pvz., Escherichia coli arba sacharozę, pvz., Yersinia enterocolitica arba Proteus penneri, sudaro žalsvai juodą nuosėdą, suteikiančią būdingą metalo blizgesį šioms rūšims.

Pažymėtina, kad jei naudojama EMB levino terpė (be sacharozės), Yersinia enterocolitica ir Proteus penneri gamins aiškias kolonijas.

Bakterijos, kurios fermentuoja laktozę ar sacharozę, maitinamos peptonų, kurie suteikia bakterijų vystymuisi reikalingas aminorūgštis ir azotą, ir gamina aiškias kolonijas. Pavyzdžiui, be kita ko, Salmonella ir Shigella gentys.

Taip pat svarbu pažymėti, kad „Acinetobacter“ gentis gali pateikti mėlynos levandų kolonijas, nors tai nėra laktozės fermentas, o taip pat sacharozė, tačiau jos savybė yra fiksuoti metileno mėlyną savo ląstelių sienelėje. Taip gali atsitikti ir su kitomis oksidacinėmis bakterijomis.

Paruošimas

Originali dehidratuota terpė yra šviesiai smėlio spalvos.

Šiai auginimo terpei paruošti reikia pasverti 36 g dehidratuotos terpės ir suspenduoti buteliuke, kuriame yra vienas litras distiliuoto vandens.

Po to, kai mišinys buvo paliktas 5 minutes po poilsio, atneškite fiola į šilumos šaltinį, energingai ir nuolat maišant, kol jis virs, ir visiškai ištirps.

Vėliau jau ištirpinta terpė turi būti sterilizuojama naudojant autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių.

Pasibaigus laikui, jis pašalinamas iš autoklavo ir trumpam paliekamas. Tada kiekvienoje sterilioje Petri lėkštelėje patiekiama net karšta (45–50 ° C) nuo 15 iki 20 ml agaro. Laikmena turėtų būti mėlyna lakmus.

Išdavus plokšteles šiek tiek atidengta, kol agaras atvės. Tada jie uždengiami ir leidžiama visiškai sukietėti. Vėliau jie užsakomi apverstos plokštelės laikiklyje ir laikomi šaldytuve (8 ° C) iki naudojimo.

Kad būtų išvengta užteršimo, ši procedūra pageidautina atlikti laminarinio srauto gaubte arba prieš Bunseno degiklį.

Svarbu nepamiršti, kad kiekvienas komercinis namas nurodys sveriamą kiekį, kad būtų galima paruošti auginimo terpę.

Galutinis terpės pH turi būti 7, 2 ± 0, 2

Naudojimas

Ši terpė naudojama šlapimui ir išmatoms ar bet kokio tipo klinikiniams mėginiams sėti, ypač jei įtariama, kad yra nereikalingų gramnegatyvių bacilių, tokių kaip Enterobacteriaceae šeimai priklausančios bakterijos, kurios labai gerai auga šioje terpėje.

Shigella ir Salmonella genties enteropatogeninės bakterijos išsiskiria bespalvėmis arba šiek tiek gintarinėmis kolonijomis.

Taip pat auga ir kiti nefermentuojantys laktozės bacilai, pvz., Aeromonas, Pseudomonas, Acinetobacter.

Be to, ši terpė yra labai naudinga maisto ir vandens mikrobiologinei analizei, nes ji idealiai tinka visai patvirtinančiai koliformų nustatymo fazei, ty patvirtinti E. coli buvimą drumstose EB sultyse, nuo labiausiai tikėtino skaičiavimo metodo (NMP).

Kokybės kontrolė

Siekiant patikrinti, ar naujai paruošta auginimo terpė gerai veikia, kontroliniai padermės gali būti sodinamos siekiant stebėti kolonijų charakteristikas ir patikrinti, ar jos atitinka numatytas sąlygas.

Tam gali būti naudojamos ATCC padermės arba gerai identifikuoti E. coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp, Salmonella typhimurium, Shigella flexneri, Pseudomonas aeruginosa ir kai kurių gramteigiamų bakterijų, pvz., S. aureus, padermės .

Tikimasi, kad E. coli sukurs gerai išvystytas melsvai juodas kolonijas su žaliu metaliniu blizgesiu. Tuo tarpu „ Enterobacter aerogenes“ ir „ Klebsiella sp“ turi suteikti gerai išvystytas mėlynai juodos gleivinės kolonijas.

Kita vertus, „ Salmonella typhimurium“ ir „ Shigella flexneri“ turi sukurti didelius bespalvius arba šiek tiek geltonos spalvos kolonijas.

Galiausiai, Pseudomonas aeruginosa gentis auga kaip bespalvės, netaisyklingos dydžio kolonijos, o gramteigiamos bakterijos turi būti visiškai slopinamos arba augančios taupiai su labai mažomis kolonijomis.

Galutinės pastabos

Kartais sterilizacija sumažina metileno mėlyną, stebint oranžinę terpę. Kad metileno mėlynas oksiduotųsi ir purpurinė spalva atsigautų, ji turi būti švelniai sumaišoma, kol spalva atsigaus.

Be to, po sterilizavimo dažai gali nusodinti, todėl prieš patiekdami Petri lėkšteles, jis turi būti gerai sumaišytas.