Katalazės testas: pamatas, technika ir panaudojimas
Katalazės tyrimas yra metodika, naudojama bakteriologijos laboratorijose, siekiant parodyti katalazės fermento buvimą tose bakterijose, kurios ją turi. Kartu su gramatine spalva yra pagrindiniai bandymai, kuriuos reikia atlikti naujai izoliuotiems mikroorganizmams. Šie tyrimai padeda mikrobiologui atlikti veiksmus, kurių reikia laikytis, kad būtų galima galutinai nustatyti atitinkamą mikroorganizmą.
Apskritai, bakterijos, turinčios citochromą, turi katalazės fermentą, ty turi būti aerobinių ir fakultatyvinių anaerobinių bakterijų. Tačiau yra išimčių, pvz., Streptococcus, kuris, nepaisant to, kad yra fakultatyvūs anaerobiniai mikroorganizmai, neturi katalazės fermento.
Štai kodėl katalazės testas naudojamas daugiausia siekiant atskirti Straphococaceae šeimos (katalazės neigiamas) šeimas Staphylococeaeae ir Micrococaceae (abu katalazinius teigiamus).
Be to, be kita ko, Bacillus gentis (katalazė teigiama) skiriasi nuo Clostridium genties (katalazės neigiamas).
Fondas
Katalazė yra fermentas, klasifikuojamas kaip hidroperoksidazė, tai reiškia, kad jie naudoja vandenilio peroksidą (H 2 O 2 ) kaip substratą.
Jis taip pat laikomas oksidoreduktaze, nes reakcijoje, kurioje yra elementas, kuris tarnauja kaip elektronų donoras (redukuojanti medžiaga) ir kitas kaip elektronų receptorius (oksidantas).
Katalazė yra baltymas, turintis protezų grupę su keturiais trivalentiais geležies atomais (Fe +++), todėl jis yra homoproteinas. Geležies jonas reakcijos metu išlieka oksiduotas.
Galima sakyti, kad katalazė yra detoksikuojantis fermentas, nes jo funkcija yra pašalinti bakterijų apykaitoje susidarančias medžiagas, kurios yra toksiškos bakterijoms. Tarp šių medžiagų yra vandenilio peroksidas.
Vandenilio peroksidas susidaro iš cukraus skaidymo aerobiniu būdu. Šis procesas vyksta taip:
Superoksido jonas (O2 -) (laisvasis radikalas) susidaro kaip galutinis gliukozės asimiliacijos aerobiniu būdu produktas. Tai yra toksiška ir pašalinama fermento superoksido dismutaze, kuri ją paverčia dujiniu deguonimi ir vandenilio peroksidu.
Vandenilio peroksidas taip pat yra toksiškas bakterijoms ir turėtų būti pašalintas. Katalazės fermentas išskiria vandenilio peroksidą vandenyje ir deguonyje.
Katalazė gali veikti kitiems substratams nei vandenilio peroksidas, pavyzdžiui, alkoholiai, aldehidai, rūgštys, aromatiniai aminai ir fenoliai. Tačiau katalazė taip pat gali naudoti vandenilio peroksidą, kad oksiduotų kitus toksiškus junginius, tokius kaip metilas ir etilo alkoholis.
Panašiai katalazė yra fagocitinėse ląstelėse, apsauganti nuo toksinio vandenilio peroksido poveikio.
Įprastinė katalazės bandymo technika
-Object metodas
Medžiagos
3% vandenilio peroksido (10 tūrių).
Stiklą stumkite
Vienkartinės plastikinės rankenos arba medinės lazdelės.
Procedūra
Paimkite pakankamai kolonijos studijuoti nepaliesdami agaro, iš kurio jis kilęs. Kolonija turi būti šviežia, ty nuo 18 iki 24 valandų.
Įdėkite koloniją ant sauso stiklelio ir ant jo pridėkite 3% vandenilio peroksido lašą (taip pat galima naudoti 30% H2O2). Nedelsiant stebėkite, ar išleidžiami burbuliukai.
Aiškinimas
Teigiama reakcija: dujų išsiskyrimas, kurį patvirtina burbuliukų susidarymas (stiprus burbuliavimas).
Neigiama reakcija: nėra burbulo susidarymo.
- Tiesioginis metodas grynoje kultūroje
Į gryną kultūrą įpilkite 1 ml 3% H2O2 į plokšteles ar pleištus, kuriuose nėra kraujo (geriau maistinio agaro). Stebėkite, ar burbulo susidarymas yra iš karto. Taip pat galite naudoti H 2 O 2 30%.
Jis aiškinamas taip pat, kaip ir objekto perkėlimo metodas.
-Metodas su kapiliariniu vamzdeliu arba Fung ir Petrishko
Užpildykite 67 mm kapiliarinį vamzdelį 20 mm aukštyje su 3% vandenilio peroksidu kapiliarumu.
Palieskite izoliuotą koloniją, kurią norite studijuoti su kapiliaru, pripildytu 3% H2O 2 . Stebėkite, ar kapiliarą maždaug per 10 sekundžių užpildo burbuliukai. Šis metodas leidžia pusiau kiekybiškai įvertinti kryžminę reakciją:
Be kryžių nėra burbuliukų (neigiama reakcija).
+ ---- Maži burbuliukai (silpna arba vėluojama reakcija).
++ Gausūs burbuliukai (vidutinė reakcija).
+++ - Burbulai pasiekia priešingą kraštutinumą (energinė reakcija).
-Taylor ir Achanzar metodas katalaziniams testams, kurie duoda abejonių
Ant švarios, sausos stiklelio padėkite izoliuotą koloniją, tada įpilkite 0, 5% H 2 O 2 lašą ir padenkite dangčiu. Atkreipkite dėmesį į tai, ar yra susikaupusių burbuliukų.
Aiškinimas: burbuliukų buvimas rodo teigiamą reakciją. Be burbuliukų jis yra interpretuojamas kaip neigiama reakcija.
Mycobacterium rūšių katalazės tyrimas
Šį metodą reikia atlikti kontroliuojant pH ir temperatūrą. Jis turi būti naudojamas pagal laminarinio srauto gaubtą, nes skirtingų Mycobacterium rūšių naudojimas yra pavojingas.
- Medžiagos
Vandenilio peroksidas, kurio tūris yra 30% arba 110 (superoksalas).
PH 7 fosfato buferis
10% Tween 80
Mycobacterium pleišto auginimas nuo 3 iki 4 savaičių
- Reagentų paruošimas
PH 7 fosfato buferis
Pasverkite:
1, 361 g bevandenio monokalio fosfato (KH2P04).
1, 420 g bevandenio dinatrio (Na2HPO3) fosfato.
Abi druskas ištirpinkite šiek tiek steriliame distiliuotame vandenyje ir užpilkite vandeniu iki 1000 ml.
10% Tween 80
Padarykite 1:10 skiedimą iki Tween 80, kuris yra komerciškai koncentruotas, taip atlikite taip:
Paimkite 1 ml Tween 80 ir supilkite jį į šiek tiek distiliuoto vandens, ištirpinkite ir užpildykite vandeniu iki 10 ml.
Galutinis reagentas
Sumaišykite fosfatinio buferio kiekį 10% Tween 80 (lygiomis dalimis). Nustatykite laboratorijoje, kiek norite parengti.
- Procedūra
Į sterilų mėgintuvėlį su užsukamu dangteliu (Bakelitas) įpilkite 5 ml fosfato buferio.
Su inokuliacijos kilpa, paimkite pakankamą Mycobacterium augimo koloniją, įterptą į pleištus ir ištirpinkite fosfato buferyje.
Uždenkite mėgintuvėlį, neperplėšdami sriegio per daug. 20–30 minučių įpilkite į 68 ° C vandens vonią. Nuimkite ir palikite atvėsti 22-25 ° C temperatūroje
Išmatuokite 0, 5 ml galutinio reagento (mišinio) ir pridėkite jį prie mėgintuvėlio šaltu tirpalu. Stebėkite burbulų susidarymą.
Tai aiškinama kaip ankstesni metodai.
Naudokite
Kai gaunamas kolonijų augimas praturtintoje terpėje, gautos kolonijos turi būti išgautos iš Gramo ir katalazės. Tai padės mikrobiologui nustatyti procedūras, kurių reikia laikytis nustatant galutinį identifikavimą.
Kokybės kontrolė
Siekiant įvertinti tinkamą vandenilio peroksido reagento veikimą, naudokite šviežiai auginamus kontrolinius padermes, tokius kaip Staphylococcus aureus, kaip teigiamą kontrolę, ir Streptococcus sp padermes kaip neigiamą kontrolę.
Kita alternatyva, kuri yra teigiama kontrolė, yra įpilti vandenilio peroksido lašą ant kraujo agaro, eritrocitai turi katalazę, todėl, jei reagentas yra geros būklės, bus burbuliuoja.
Šokolado agarą galima naudoti kaip neigiamą kontrolę, čia eritrocitai jau yra lizuoti ir bandymas yra neigiamas.
Apribojimai
-Nenaudokite senų kultūrų bandymui, nes tai gali sukelti klaidingus neigiamus rezultatus.
- Venkite kolonijų iš kultūrų kraujo agare, jei nesilaikysite agaro; ši procedūra gali sukelti klaidingus teigiamus rezultatus, nes eritrocitai turi katalazę.
-Jei jūs paėmėte koloniją su platinos rankena, nepakeiskite procedūros tvarkos, nes tai gali sukelti klaidingus teigiamus rezultatus. Taip yra todėl, kad platina gali reaguoti su vandenilio peroksidu ir sukelti burbuliavimą.
-Nenaudokite vandenilio peroksido reagento, jei jis yra per senas, nes reagentas yra labai nestabilus ir linkęs su laiku suskaidyti.
-Saugokite vandenilio peroksido reagentą, apsaugotą nuo šviesos ir šaldymo, kad išvengtumėte žalos.
- Kiekvieną kartą naudokite vandenilio peroksido reagento kokybės kontrolę.
- Atkreipkite dėmesį, kad jei H 2 O 2 yra naudojamas 30%, reakcijos yra stipresnės už tas, kurios yra pagamintos naudojant 3% H2O2.
